A proteína ‘Magneto’ geneticamente modificada controla remotamente o cérebro e o comportamento
O novo método “Badass” usa uma proteína magnetizada para ativar as células cerebrais de forma rápida, reversível e não invasiva
A câmara magnética toroidal (Tokamak) do Joint European Torus (JET) no Culham Science Center. Fotografia: AFP / Getty Images
Mo Costandi
Qui, 24 de março de 2016
Pesquisadores nos Estados Unidos desenvolveram um novo método para controlar os circuitos cerebrais associados a comportamentos animais complexos, usando engenharia genética para criar uma proteína magnetizada que ativa grupos específicos de células nervosas à distância.
Entender como o cérebro gera comportamento é um dos objetivos finais da neurociência – e uma de suas questões mais difíceis. Nos últimos anos, os pesquisadores desenvolveram uma série de métodos que os permitem controlar remotamente grupos específicos de neurônios e sondar o funcionamento dos circuitos neuronais.
O mais poderoso deles é um método chamado optogenética , que permite aos pesquisadores ligar ou desligar populações de neurônios relacionados em uma escala de tempo de milissegundo a milissegundo com pulsos de luz laser. Outro método desenvolvido recentemente, chamado quimogenética , usa proteínas projetadas que são ativadas por drogas projetadas e podem ser direcionadas a tipos específicos de células.
Embora poderosos, ambos os métodos têm desvantagens. A optogenética é invasiva, exigindo a inserção de fibras ópticas que entregam os pulsos de luz ao cérebro e, além disso, a extensão em que a luz penetra no tecido cerebral denso é severamente limitada. As abordagens quimiogenéticas superam essas duas limitações, mas normalmente induzem reações bioquímicas que levam vários segundos para ativar as células nervosas.
A nova técnica, desenvolvida no laboratório de Ali Güler na University of Virginia em Charlottesville, e descrita em uma publicação online avançada na revista Nature Neuroscience , não é apenas não invasiva, mas também pode ativar neurônios de forma rápida e reversível.
Vários estudos anteriores mostraram que as proteínas das células nervosas que são ativadas por calor e pressão mecânica podem ser geneticamente modificadas para que se tornem sensíveis a ondas de rádio e campos magnéticos , anexando-os a uma proteína armazenadora de ferro chamada ferritina, ou a partículas paramagnéticas inorgânicas . Esses métodos representam um avanço importante – eles já foram, por exemplo, usados para regular os níveis de glicose no sangue em camundongos – mas envolvem vários componentes que devem ser introduzidos separadamente.
A nova técnica se baseia neste trabalho anterior e é baseada em uma proteína chamada TRPV4, que é sensível tanto à temperatura quanto às forças de alongamento . Esses estímulos abrem seu poro central, permitindo que a corrente elétrica flua através da membrana celular; isso evoca impulsos nervosos que viajam para a medula espinhal e, em seguida, para o cérebro.
Güler e seus colegas raciocinaram que as forças de torque magnético (ou rotativas) podem ativar o TRPV4 puxando seu poro central, e então eles usaram a engenharia genética para fundir a proteína à região paramagnética da ferritina, junto com sequências curtas de DNA que sinalizam as células para transportar proteínas na membrana da célula nervosa e inseri-las nela.
Quando eles introduziram essa construção genética em células renais embrionárias humanas crescendo em placas de Petri, as células sintetizaram a proteína ‘Magneto’ e a inseriram em sua membrana. A aplicação de um campo magnético ativou a proteína TRPV1 projetada, como evidenciado por aumentos transitórios na concentração de íons de cálcio dentro das células, que foram detectados com um microscópio de fluorescência.
Em seguida, os pesquisadores inseriram a sequência de DNA do Magneto no genoma de um vírus, junto com o gene que codifica a proteína fluorescente verde e sequências de DNA regulatórias que fazem com que a construção seja expressa apenas em tipos específicos de neurônios. Eles então injetaram o vírus no cérebro de camundongos, visando o córtex entorrinal, e dissecaram os cérebros dos animais para identificar as células que emitiam fluorescência verde. Usando microeletrodos, eles mostraram que a aplicação de um campo magnético nas fatias do cérebro ativou Magneto para que as células produzissem impulsos nervosos.
Para determinar se Magneto pode ser usado para manipular a atividade neuronal em animais vivos, eles injetaram Magneto em larvas de peixe-zebra, visando neurônios no tronco e cauda que normalmente controlam uma resposta de escape. Eles então colocaram as larvas do peixe-zebra em um aquário magnetizado especialmente construído e descobriram que a exposição a um campo magnético induzia manobras de enrolamento semelhantes às que ocorrem durante a resposta de fuga. (Este experimento envolveu um total de nove larvas de peixe-zebra, e análises subsequentes revelaram que cada larva continha cerca de 5 neurônios que expressam Magneto.)
Em um experimento final, os pesquisadores injetaram Magneto no corpo estriado de camundongos que se comportavam livremente, uma estrutura cerebral profunda contendo neurônios produtores de dopamina que estão envolvidos na recompensa e motivação, e então colocaram os animais em um aparelho dividido em seções magnetizadas e não magnetizadas . Os camundongos que expressam Magneto passaram muito mais tempo nas áreas magnetizadas do que os que não o fizeram, porque a ativação da proteína fez com que os neurônios do estriado que a expressassem liberassem dopamina, de modo que os camundongos descobriram estar nessas áreas gratificantes. Isso mostra que Magneto pode controlar remotamente o disparo de neurônios nas profundezas do cérebro, e também controlar comportamentos complexos.
O neurocientista Steve Ramirez, da Universidade de Harvard, que usa a optogenética para manipular memórias no cérebro de camundongos, diz que o estudo é “ durão ”.
“As tentativas anteriores [usando ímãs para controlar a atividade neuronal] precisavam de vários componentes para o sistema funcionar – injeção de partículas magnéticas, injeção de um vírus que expressa um canal sensível ao calor [ou] fixação da cabeça do animal para que uma bobina pudesse induzir mudanças no magnetismo ”, explica ele. “O problema de ter um sistema multicomponente é que há muito espaço para cada peça individual quebrar.”
“Este sistema é um vírus único e elegante que pode ser injetado em qualquer parte do cérebro, o que torna tecnicamente mais fácil e menos provável a quebra de sinos e assobios”, acrescenta, “e seu equipamento comportamental foi habilmente projetado para conter ímãs quando apropriado, para que os animais possam se mover livremente. ”
A ‘magnetogenética’ é, portanto, um acréscimo importante à caixa de ferramentas dos neurocientistas, que sem dúvida será mais desenvolvida e fornecerá aos pesquisadores novas maneiras de estudar o desenvolvimento e a função do cérebro.
Os neurocientistas da UCL desenvolveram um método ‘totalmente óptico’ para o registro simultâneo e alteração dos impulsos nervosos no cérebro vivo.
Os pesquisadores lêem e escrevem a atividade cerebral com luz
Uma equipe de neurocientistas da University College London desenvolveu uma nova maneira de registrar e manipular simultaneamente a atividade de várias células no cérebro de animais vivos usando pulsos de luz.
A técnica, descrita hoje na revista Nature Methods , combina duas neurotecnologias de última geração existentes. Pode eventualmente permitir que os pesquisadores acabem com os microeletrodos incômodos que tradicionalmente usavam para sondar a atividade neuronal e interroguem o funcionamento do cérebro no nível celular em tempo real e com detalhes sem precedentes.
Um deles é a optogenética. Isso envolve a criação de camundongos geneticamente modificados que expressam proteínas de algas chamadas Channelrhodopsinas em grupos específicos de neurônios. Isso torna as células sensíveis à luz, permitindo aos pesquisadores ligá-las ou desligá-las, dependendo de qual proteína Channelrodopsina elas expressam e de qual comprimento de onda de luz é usado. Isso pode ser feito em uma escala de tempo de milissegundo por milissegundo, usando pulsos de luz laser lançados no cérebro dos animais por meio de uma fibra óptica.
Os corantes sensíveis ao cálcio são injetáveis, portanto, direcioná-los com precisão é difícil e, mais recentemente, os pesquisadores desenvolveram sensores de cálcio codificados geneticamente para superar essa limitação. Os camundongos podem ser geneticamente modificados para expressar essas proteínas sensíveis ao cálcio em grupos específicos de células; como os corantes antes deles, eles também fluorescem em resposta a aumentos nas concentrações de íons de cálcio nas células que os expressam.
Cada um desses métodos é extremamente poderoso quando usado sozinho. No início deste ano, por exemplo, pesquisadores do MIT usaram optogenética para rotular e, em seguida, manipular as populações neuronais que codificam memórias no cérebro do rato, enquanto uma equipe da Janelia Farm usou imagens de cálcio para visualizar o disparo de cada neurônio no cérebro do peixe-zebra embrionário.
Adam Packer e seus colegas criaram uma linhagem de camundongos que expressa a proteína Channelrhodopsina e uma proteína ultrassensível de ligação ao cálcio em neurônios no córtex barril, a parte do cérebro que recebe informações sensoriais dos bigodes. Dessa forma, eles poderiam ativar optogeneticamente células específicas enquanto também usavam imagens de cálcio de alta velocidade para visualizar como elas e outras células da população reagem à estimulação, através de ‘janelas’ transparentes raspadas nos crânios dos animais.
A combinação de métodos permitiu aos pesquisadores determinar quais neurônios contribuem para uma função específica e, em seguida, direcioná-los com muita precisão. Para demonstrar a precisão da técnica, eles usaram um dispositivo programável chamado modulador de luz espacial que divide o feixe de luz em um holograma consistindo de ‘feixes’ menores e, em seguida, ativou simultaneamente seis neurônios dispostos em forma de um rosto sorridente.
Existem outras maneiras de ler e escrever simultaneamente a atividade neuronal, mas elas têm desvantagens. Microeletrodos sozinhos podem ser usados para estimular algumas células e registrar de outras, ou eletrodos estimulantes podem ser combinados com uma técnica de imagem. Isso produz interferência entre os canais de entrada e saída, no entanto, que pode afetar os resultados.
Com a nova abordagem, a frequência da luz usada para estimular os neurônios não se sobrepõe à emitida pelo sensor de cálcio, então há interferência mínima entre os dois canais, e o feixe de luz holográfico estimula os neurônios com um procedimento de ‘varredura rápida’ que dura apenas 2 femtossegundos (bilionésimos de segundo), o que reduz ainda mais a interferência.
Os experimentos mostram que o novo método totalmente óptico pode, de fato, ser usado para gravar e interferir simultaneamente na atividade de populações neuronais. Eles também mostram que pode ser usado continuamente por várias semanas, ou mesmo meses, em animais acordados e comportados. Os pesquisadores sem dúvida continuarão a desenvolver e aprimorar o método, a fim de aprender mais sobre a ligação entre o cérebro e o comportamento e decifrar os códigos neurais correspondentes.
“Estamos entusiasmados com isso”, diz o autor sênior Michael Häusser. “Ele une duas revoluções na neurociência e anuncia uma nova era em que podemos abandonar os eletrodos e usar apenas a luz para sondar os circuitos neurais durante o comportamento.”
Referência: Wheeler, MA, et al . (2016). Controle magnético do sistema nervoso com alvos genéticos. Nat. Neurosci ., DOI: 10.1038 / nn.4265 [ Resumo ]
Referência : Packer, AM, et al . (2014). Manipulação totalmente óptica simultânea e registro da atividade do circuito neural com resolução celular in vivo. Nat. Métodos , publicação online avançada. DOI: 10.1038 / Nmeth.3217
Controle remoto da atividade cerebral com nanopartículas aquecidas
Os pesquisadores estão desenvolvendo um novo método de estimulação cerebral profunda sem fio.
Os pesquisadores têm vários métodos para manipular a atividade das células cerebrais, sem dúvida o mais poderoso sendo a optogenética, que lhes permite ligar ou desligar células cerebrais específicas com precisão sem precedentes e, simultaneamente, registrar seu comportamento , usando pulsos de luz.
Isso é muito útil para sondar circuitos neurais e comportamento, mas envolve primeiro a criação de camundongos geneticamente modificados com neurônios sensíveis à luz e, em seguida, a inserção das fibras ópticas que fornecem luz ao cérebro, portanto, existem grandes barreiras técnicas e éticas para seu uso em humanos .
Eles, portanto, anexaram nanobastões de ouro a três moléculas diferentes que reconhecem e se ligam a proteínas nas membranas celulares – a toxina do escorpião Ts1, que se liga a um canal de sódio envolvido na produção de impulsos nervosos, e anticorpos que ligam os canais P2X3 e TRPV1 , ambos encontrados nos neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG), que transmitem informações de toque e dor pela medula espinhal e pelo cérebro.
Os pesquisadores adicionaram essas partículas aos neurônios DRG crescendo em placas de Petri, para que eles se ligassem às células exibindo as proteínas relevantes em sua superfície. Eles então expuseram as células a pulsos de milissegundos de luz visível, que aqueceram as partículas, fazendo com que as células disparassem impulsos nervosos em resposta. Isso foi possível não apenas em neurônios isolados, mas também em fatias de tecido do hipocampo de rato. Em ambas as situações, as partículas permaneceram firmemente no lugar quando adicionadas em baixas concentrações, permitindo a estimulação repetida das células por mais de meia hora.
A equipe de Polina Anikeeva no Instituto de Tecnologia de Massachusetts adotou uma abordagem ligeiramente diferente, usando partículas esféricas de óxido de ferro que emitem calor quando expostas a um campo magnético alternado.
Primeiro, eles injetaram um vírus carregando o gene TRPV1 no tegmento ventral de camundongos, para que os neurônios captassem o vírus e expressassem o gene, tornando-os sensíveis ao calor. Um mês depois, eles injetaram as nanopartículas na mesma parte do cérebro e, em seguida, aplicaram campos magnéticos a ela. Isso fez com que as nanopartículas emitissem calor o suficiente para ativar os canais TRPV1, fazendo com que os neurônios disparassem longas sequências de impulsos nervosos.
Os neurônios engolfam nanopartículas de óxido de ferro, e os pesquisadores descobriram que as partículas injetadas persistiram no cérebro dos animais, de modo que puderam continuar a ativar células no tegmento ventral por até um mês depois, causando menos danos aos tecidos do que o aço inoxidável implantável eletrodos.
Ambos os métodos são bastante limitados em sua especificidade. As nanopartículas de ouro se ligam apenas aos vários tipos de células que expressam o canal de sódio, P2X3 ou TRPV1, enquanto o vírus TRPV1 e as partículas de óxido de ferro entram nas células aleatoriamente no local da injeção. Isso é facilmente resolvido, já que as nanopartículas podem ser conjugadas a praticamente qualquer molécula, mas embora ambos os métodos possam ativar neurônios, nenhum dos dois pode inibi-los, e não está claro como eles podem ser ajustados para fazer isso.
Nanopartículas já estão sendo usadas em outros campos. Eles podem, por exemplo, atingir e destruir células malignas e, portanto, mostram-se promissores na terapia do câncer . Mais recentemente, alguns pesquisadores exploraram sua capacidade de se esgueirar pela barreira hematoencefálica e os usaram para visualizar e reduzir o dano causado por derrame e a inflamação em ratos.
Embora ainda em fase experimental, pesquisas como essa podem eventualmente permitir a estimulação cerebral profunda sem fio e minimamente invasiva do cérebro humano. O objetivo do grupo de Bezanilla é aplicar seu método para desenvolver tratamentos para a degeneração macular e outras condições que eliminam as células fotossensíveis da retina. Isso envolveria a injeção de nanopartículas no olho para que se ligassem a outras células da retina, permitindo que a luz natural as excitasse e disparasse impulsos para o nervo óptico.
Referências : Carvalho-de-Souza, JL, et al . (2015). Fotossensibilidade de neurônios ativados por nanopartículas de ouro direcionadas a células. Neuron , DOI: 10.1016 / j.neuron.2015.02.033
Chen, R., et al . (2015). Estimulação cerebral profunda magnetotérmica sem fio. Science , DOI: 10.1126 / science.1261821 [ PDF ]
https://www.theguardian.com/science/neurophilosophy/2014/dec/22/researchers-read-and-write-brain-activity-with-light
https://www.theguardian.com/science/neurophilosophy/2015/mar/24/remote-control-brain-activity-nanoparticles
